KAMIYA KT-26867說明書

KAMIYA BIOMEDICAL COMPANY

人蛋白零點，髓鞘 (MPZ) ELISA

用于定量測定組織勻漿、細胞培養上清液和其他生物體液中的人 MPZ

目錄號編號KT-26867

僅供研究使用。不得用于診斷程序。

產品信息

人蛋白零點，髓鞘 (MPZ) ELISA

目錄號編號KT-26867

Human Protein Zero, Myelin

(MPZ) ELISA

預期用途

該試劑盒是一種夾心酶免疫分析法，用于體外定量測定組織勻漿、細胞培養上清液和其他生物體液中的人 MPZ。僅供研究使用。不適用于  用于診斷程序。

組件

需要但未提供的材料

• 帶有 450±10 nm 濾光片的酶標儀。
• 精密單通道和多通道移液器和一次性吸頭。
• 用于稀釋樣品的 Eppendorf 管。
• 去離子水或蒸餾水。
• 吸水紙吸干微量滴定板。
• 清洗液容器。

儲存

所有試劑應根據小瓶上的標簽進行保存。接收后，校準品、檢測試劑 A、檢測試劑 B 和 96 孔板條應儲存在-20 ℃。未使用的試劑條應保存在密封袋中，并提供干燥劑，以盡量減少暴露于潮濕空氣中。開封的檢測試劑盒將在所示失效日期前保持穩定，前提是其按照上述規定儲存。

原理

該試劑盒中提供的微量滴定板已用 MPZ 特異性抗體預包被。然后將校準品或樣品加入到含有 MPZ 特異性生物素結合抗體制劑的適當微量滴定板孔中。然后，向每個微孔板小孔中加入與辣根過氧化物酶 (HRP) 結合的抗生物素蛋白并孵育。然后向各孔中加入 TMB 底物溶液。只有那些含有 MPZ、生物素偶聯抗體和酶偶聯抗生物素蛋白的孔才會出現顏色變化。

加入硫酸溶液終止酶-底物反應，并采用分光光度法在 450 nm±10 nm 波長處測定顏色變化。然后通過比較樣品的 O.D. 值與校準曲線，測定樣品中 MPZ 的濃度。

樣本采集和儲存

組織勻漿

組織勻漿的制備因組織類型而異。對于本試驗，在冰冷 PBS (0.02 mol/L，pH 7.0-7.2) 中沖洗組織，以*除去過量血液，并在勻漿前稱重。將組織制成小塊，置于冰上，用玻璃勻漿器在 5-10 mL PBS 中勻漿化（Micro tissue Grinders 也工作）。用超聲細胞破碎儀對所得混懸液進行超聲處理或進行兩次凍融循環以進一步破碎細胞膜。然后，將勻漿在 5,000 xg 下離心 5 min。立即除去上清液并進行試驗，或等分并儲存在≤-20 ℃ 下。

細胞培養上清液和其他生物體液

以 1,000 xg 離心樣品 20 min。立即除去微粒并進行測定，或將樣品等分試樣儲存在-20 ℃ 或-80 ℃ 下備用。避免反復凍融循環。

注：

1. 5 天內使用的樣品可在 4 ℃ 下儲存，否則樣品必須在-20 ℃（≤1 個月）或-80 ℃（≤2 個月）下儲存，以避免生物活性損失和污染。

• 樣本溶血會影響結果，因此溶血標本無法檢出。
• 進行分析時，將樣品緩慢恢復至室溫。

試劑制備

使用前，將所有試劑盒組分和樣本置于室溫 (18-25 ℃) 下。

校準品

用 0.1 mL 校準品稀釋液復溶校準品，在室溫下保持 10 min，輕輕振搖（不要起泡）。儲備液中校準品的濃度為 10 ng/mL。請制備 7 支含 0.5 mL 校準品稀釋液的試管，并根據下圖制備雙倍稀釋系列。在下一次轉移前，充分混合各試管。設置 7 個點的稀釋校準品，如 10 ng/mL、5 ng/mL、2.5 ng/mL、1.25 ng/mL、0.625 ng/mL、0.312 ng/mL、0.156 ng/mL，后一個含有校準品稀釋液的 EP 管作為空白 (0 ng/mL)。

試驗稀釋劑 A 和 B

用 6 mL 去離子水或蒸餾水稀釋 6 mL 試驗稀釋劑 A 或 B 濃縮液 (2X)，制備 12 mL 試驗稀釋劑 A 或 B。制備的工作稀釋液不能冷凍。

檢測試劑 A 和 B

使用前短暫旋轉或離心儲備檢測試劑 A 和檢測試劑 B。分別用工作試驗稀釋劑 A 或 B 稀釋至工作濃度 (1:100)。

清洗溶液

用 580 mL 去離子水或蒸餾水稀釋 20 mL 清洗液濃縮液 (30X)，制備 600 mL 清洗液 (1X)。

TMB 底物

用無菌吸頭吸取所需劑量的溶液，不得將殘留溶液再次倒入小瓶中。

注：

1. 不允許在孔中直接進行連續稀釋。

2. 在測定前 15 min 內制備校準品。請勿在 37 ℃ 下直接溶解試劑。

• 請按照說明仔細復溶校準品或工作檢測試劑 A 和 B，避免起泡并輕輕混合，直至晶體*溶解。為盡量減少移液引起的不精密度，應使用小體積并確保移液器經過校準。建議抽吸 10µL 以上，用于一次移液。

4. 復溶的校準品、檢測試劑 A 和檢測試劑 B 只能使用一次。

5. 如果在清洗溶液濃縮液 (30X) 中形成晶體，則加熱至室溫并輕輕混合，直至晶體*溶解。

6. 試劑配制用水或容器受污染會影響檢測結果。

樣品制備

• Kamiya Biomedical Company 僅對試劑盒本身負責，不對檢測過程中消耗的樣本負責。用戶應計算整個測試中可能使用的樣本數量。請提前預留足夠的樣本。

2. 請在測定前預測濃度。如果這些值不在校準曲線范圍內，則用戶必須確定其特定實驗的宜樣本稀釋度。

3. 如果手冊中未指明樣本，則需要進行初步實驗以確定試劑盒的有效性。

4. 用化學裂解緩沖液制備的組織或細胞提取樣品，由于某些化學物質的影響，可能會引起意想不到的 ELISA 結果。

• 由于其他來源的抗原可能與我們試劑盒中使用的抗體不匹配（例如，抗體靶向構象表位而不是線性表位），我們的產品可能無法識別其他生產商的一些天然或重組蛋白。

6. 受細胞活性、細胞數量和取樣時間等因素的影響，試劑盒可能無法檢測細胞培養上清液樣本。

7. 建議使用未經長期儲存的新鮮樣本進行試驗。否則，這些樣品可能發生蛋白質降解和變性，終導致錯誤的結果。

試驗程序

• 測定稀釋校準品、空白和樣本孔。校準品制備 7 孔，空白制備 1 孔。向適當孔中分別加入 100µL 校準品稀釋液（讀取試劑制備液）、空白和樣本。用封板覆膜覆蓋。在 37 ℃ 下孵育 2 小時。

2. 清除每個孔中的液體，不要清洗。

• 向各孔中加入 100µL 檢測試劑 A 工作溶液。用封板覆膜覆蓋后，在 37 ℃ 下孵育 1 小時。

• 吸取溶液，使用噴射瓶、多通道移液器、歧管分配器或自動清洗器用 350µL 1X 清洗液清洗每個孔，靜置 1-2 min。通過將平板卡在吸水紙上，*去除所有孔中的剩余液體。重復 3 次。后一次洗滌后，通過抽吸或傾析去除任何剩余的洗滌緩沖液。倒置平板，在吸水紙上吸干。

• 向各孔中加入 100µL 檢測試劑 B 工作溶液。用封板覆膜覆蓋后，在 37 ℃ 下孵育 30 min。

6. 按照步驟 4 重復抽吸/清洗過程 5 次。

• 向各孔中加入 90µL 底物溶液。用新的封板機蓋住。在 37 ℃ 下孵育 15-25 min（不得超過 30 min）。避光保存。加入底物溶液后，液體將變為藍色。

• 向各孔中加入 50µL 終止液。加入終止液后，液體將變為黃色。輕敲微孔板一側，混勻液體。如果顏色變化不均勻，輕敲平板以確保充分混合。

• 除去任何一滴水和平板底部的指紋，并確認液體表面無氣泡。然后，運行酶標儀，立即在 450 nm 處測定。

注：

• 試驗制備：保留適當數量的條帶用于 1 次實驗，并從微量滴定板中取出額外的條帶。取出的試劑條應重新密封，并在-20 ℃ 下儲存，直至試劑盒失效日期。
• 樣本或試劑添加：請使用新鮮制備的校準品。請小心地將樣品加入孔中，并輕輕混合以避免起泡。盡可能不要接觸孔壁。對于程序中的每個步驟，將試劑或樣本添加到測定板的總分配時間不應超過 10 min。這將確保每個移液步驟的運行時間相等，不會中斷。盡管不要求，但建議重復檢測所有校準品和標本。為避免交叉污染，在每個校準品水平添加之間、樣本添加之間和試劑添加之間更換移液器吸頭。此外，每種試劑使用單獨的儲液器。
• 孵育：為確保結果準確，孵育步驟期間必須適當粘附封板覆膜。在各孵育步驟之間，請勿使微孔長時間處于未覆蓋狀態。試劑加入微孔板條后，在檢測過程中的任何時間都不要讓板條變干。必須觀察培養時間和溫度。
• 清洗：清洗程序至關重要。每個步驟*去除液體對于良好性能至關重要。后一次清洗后，通過抽吸或傾倒除去任何剩余的清洗液，并除去平板底部的水滴和指紋。清洗不充分將導致精密度較差和吸光度讀數假性升高。
• 反應時間的控制：觀察加入 TMB 底物后顏色的變化（如 10 min 觀察一次），如顏色過深，應提前加入終止液，避免反應過強而導致吸光度讀數不準確。

6. TMB 底物容易被污染。請避光保存。

7. 小于 60% 的環境濕度可能會對終性能產生一些影響，因此，建議在該條件下使用濕化器。

結果計算

計算各校準品、質控品和樣本重復兩次讀數的平均值，并減去平均零校準品光密度。在 log-log 圖形紙上創建校準曲線，y 軸為 MPZ 濃度，x 軸為吸光度。通過校準品點繪制宜擬合直線，可通過回歸分析確定。還建議使用一些 plot 軟件。如果樣本已被稀釋，則從校準曲線中讀取的濃度必須乘以稀釋因子。

性能

檢測范圍

0.156–10 ng/mL。

用于 ELISA 的校準曲線濃度為 10 ng/mL、5 ng/mL、2.5 ng/mL、1.25 ng/mL、0.625 ng/mL、0.312 ng/mL、0.156 ng/mL。

靈敏度

人 MPZ 的小可檢測劑量通常低于 0.052 ng/mL。本試驗的靈敏度或檢測下限 (LLD) 定義為可與零區分的低蛋白濃度。測定零校準品 20 次重復測定的平均 O.D. 值加上 3 個標準差。

特異性

該方法檢測人 MPZ 具有較高的靈敏度和*的特異性。未觀察到人 MPZ 和類似物之間存在顯著的交叉反應性或干擾。

注：受當前技能和知識的限制，我們不可能完成人 MPZ 與所有類似物的交叉反應檢測，因此交叉反應可能仍然存在。

分析方法總結

1. 準備所有試劑、樣本和校準品；

2. 向每個孔中加入 100µL 校準品或樣本。在 37 ℃ 下孵育 2 小時；

3. 加入 100µL 制備好的檢測試劑 A。在 37 ℃ 下孵育 1 小時；

4. 抽吸并清洗 3 次；

5. 加入 100µL 制備好的檢測試劑 B。在 37 ℃ 下孵育 30 min；

6. 抽吸并清洗 5 次；

7. 加入 90µL 底物溶液。在 37 ℃ 下孵育 15-25 min；

8. 加入 50µL 終止液。立即在 450 nm 處讀數。

重要說明

1. 終的實驗結果將與終端用戶的操作技能和實驗環境密切相關。請確保有足夠的樣本可用。

• 不同批次的試劑盒在檢測范圍、靈敏度和顯色時間上可能略有不同。請嚴格按照試劑盒隨附說明書進行實驗，同時使用我們網站的電子版（www.k-assay。。ｃｏｍ）僅供參考。

3. 請勿將一批試劑盒中的試劑混合或替換為另一批試劑盒。僅使用制造商提供的試劑。

4. 儲存和孵育期間，所有試劑均應避免強光照射。所有試劑瓶蓋應蓋緊，防止微生物蒸發和污染。

• 一次開板時孔內可能有一些霧狀物質。不會對終試驗結果產生任何影響。在需要之前，請勿從儲存袋中取出微量滴定板。
• 試劑制備和上樣過程中的錯誤操作，以及酶標儀參數設置不正確可能導致結果不正確。在 450±10 nm 波長下，帶寬為 10 nm 或更低、光密度范圍為 0-3 O.D. 或更高的酶標儀可用于吸光度測量。實驗前請仔細閱讀說明書并調整儀器。
• 即使是同一個操作員也可能在兩個獨立的實驗中得到不同的結果。為了獲得更好的重現性結果，應控制試驗中每個步驟的操作。此外，建議在各批次測定前進行初步實驗。
• 每個試劑盒均通過了嚴格的質量控制檢測。然而，由于一些非預期的運輸條件或不同的實驗室設備，終端用戶的結果可能與我們的內部數據不一致。不同批次試劑盒之間的批內方差也可能由上述因素引起。
• 來自不同生產商的相同產品的試劑盒可能會產生不同的結果，因為我們尚未將我們的產品與其他生產商進行比較。
• 建議與該試劑盒一起使用的終止液為酸性溶液。使用本材料時，請佩戴眼睛、手、面部和衣物。

僅供研究使用。不得用于診斷程序。