TopoGEN 公司是一家專門為拓?fù)涿秆芯刻峁┰噭┖驮噭┖小Ｔ噭┖锌梢杂行У胤治鐾負(fù)洚悩?gòu)酶 I ， II 和旋轉(zhuǎn)酶，分析細(xì)胞內(nèi)的拓?fù)湟种埔约懊枥L拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑的特性。另外公司還提供 DNa c底物，拓?fù)湟种苿┖涂贵w等。

TopoGEN TG2000G-1KIT說明書

 Purified E. coli DNA Gyrase and Relaxed DNA Kit (plasmid based). 
Catalog Numbe  TG2000G-1KIT        100 Reaction Set [50 ug DNA] 

Catalog Number TG2000G-3KIT         500 Reaction Set [250 ug DNA]

Catalog Number TG2000G-5KIT         1000 Reaction Set [500 ug DNA] 

Catalog Number TG2000G-7KIT          2000 Reaction Set [1 mg DNA]  
 
 
試劑的運(yùn)輸和儲存試劑盒在干冰上運(yùn)輸。收到DNA后，應(yīng)將其儲存在4°C，并將緩沖器儲存在-20°C。避免與質(zhì)粒頻繁的凍融循環(huán)，因?yàn)檫@可能導(dǎo)致DNA斷裂。將酶儲存在-70°C下。我們還建議在解凍后對酶進(jìn)行校準(zhǔn)（反復(fù)冷凍/解凍可能導(dǎo)致活性喪失）；酶活性在冰上穩(wěn)定1-3天。

一、導(dǎo)言
A.小結(jié)本試劑盒含有純化細(xì)菌（大腸桿菌）DNA回旋酶，純化至均一（基于SDS-PAGE）。DNA回旋酶是從高表達(dá)菌株制備的，在A2B2復(fù)合物中作為純化的全酶供應(yīng)。酶以試劑盒提供的上述質(zhì)量控制數(shù)據(jù)中給出的單位濃度供應(yīng)。DNA回旋酶儲存在穩(wěn)定緩沖液中[50 mm Tris-Cl pH 7.5，100 mm KCl，2 mm二硫三乙二醇，1 mm EDTA，50%甘油]。還包括在te中提供的底物dna（10 mm tris hcl，1 mm edta，ph 7.5）。松弛DNA的DNA濃度顯示在試管的標(biāo)簽上。
DNA回旋酶檢測試劑盒是基于對提供的松弛質(zhì)粒DNA底物（pOR322的衍生物phot1）的超螺旋作用和大約2.7kb。在以下條件下，一單位回旋酶將在37℃下1小時(shí)內(nèi)過冷500納克（0.5微克）。反應(yīng)機(jī)理如圖1所示。該酶通過一個(gè)符號反轉(zhuǎn)模型將負(fù)超螺旋引入松弛的phot1質(zhì)粒底物中。能量共因子（atp）是*超馳反應(yīng)所必需的。圖1中的嵌入凝膠圖像代表基于缺少溴化乙錠的瓊脂糖凝膠的典型底物和產(chǎn)物（超螺旋DNA）結(jié)果。這些非eb凝膠是檢測回旋酶活性的理想選擇，這一點(diǎn)已被超螺旋和松弛dna形式之間的優(yōu)異分辨率所證實(shí)。
圖形

c.dna回旋酶的質(zhì)量控制。1。通過檢測線性運(yùn)動細(xì)胞dna（kdna）和線性質(zhì)粒dna的形成，進(jìn)行核酸酶污染試驗(yàn)。1微克連環(huán)kdna或超螺旋puc19 dna的孵育（4小時(shí)。在37℃下，在10 mm mgcl2）存在下進(jìn)行。在這些條件下不產(chǎn)生線性dna或分解產(chǎn)物。2。經(jīng)SDS-PAGE分析，A和B亞基純度均大于95%，且無內(nèi)切酶。三。注：由于DNA回旋酶的高輸入水平，由于自發(fā)流產(chǎn)反應(yīng)，可能會檢測到少量的線性DNA。這很正常。

d.純化dna回旋酶的稀釋緩沖液稀釋應(yīng)在50 mm tris-cl（ph 7.5）、100 mm nacl、2 mmdithiothriteol、1 mm edta和50%甘油中進(jìn)行。

e.超卷繞試驗(yàn)條件一單位回旋酶通常與0.1至0.5微克松弛質(zhì)粒DNA在20-30微升的反應(yīng)體積中孵育1小時(shí)。在37攝氏度的緩沖液中。
AASSAY緩沖液（1份配方如下所示；試劑盒包括基于此配方的5份儲備）：35 mm Tris-Cl pH 7.5 24 mm KCl 4 mm MGCl2 2 2 mm二硫蘇糖醇1.8 mm亞精胺1 mm ATP 6.5%甘油0.1 mg BSA/ml

f.放松dna質(zhì)量控制試驗(yàn)：1。使用A260:A280讀數(shù)用分光光度法評估純度。2。在37攝氏度下單獨(dú)用回旋酶緩沖液孵育60分鐘，并沒有形成刻痕或線性DNA物種。三。用拓?fù)涓兓膁na拓?fù)洚悩?gòu)酶i（tg2005h-rc1）對超螺旋dna進(jìn)行弛豫。在這些條件下，95%以上的質(zhì)粒被放松。

g.試劑盒內(nèi)容物。給出了TG2000G-1KIT尺寸的體積。（對于較大的套件尺寸，請根據(jù)需要乘以卷，請參見第1頁了解套件尺寸）。

第1頁規(guī)定了松弛的PHOT1 DNA（總共50微克）濃度。

超螺旋PYD1 DNA（25 UL凝膠負(fù)載緩沖液）。加載2 ul作為標(biāo)記。

5倍回旋酶分析緩沖液（600微升）1倍緩沖液包含上述配方。

稀釋緩沖液（600 ul）。用這個(gè)緩沖液稀釋回旋酶。上述稀釋緩沖液配方。

5X停止緩沖/凝膠負(fù)載染料（600 UL）：5X緩沖液為5%肉桂基，0.125%溴酚藍(lán)，25%甘油。

純化DNA回旋酶（單位定義見第1頁）。
h.典型反應(yīng)混合物的方案（終體積為20 ul）

協(xié)議概要：反應(yīng)體積應(yīng)為20-30UL終體積（一般受可加載到凝膠上的體積的限制）。反應(yīng)是在微乳管中與水、緩沖液和底物phot1松弛的dna組裝的。后加入乙酰膽堿酯酶，反應(yīng)在37℃孵育15～60分鐘（或更長時(shí)間），然后用停止/負(fù)載緩沖液、蛋白酶K消化、提取和加載到瓊脂糖凝膠上結(jié)束（注意，在電泳過程中不添加溴化乙錠（EB）到凝膠或凝膠緩沖液中。在電泳分離后，使用EB對凝膠進(jìn)行染色。在某些情況下，您可能希望運(yùn)行EB凝膠（凝膠和緩沖液中的0.5U/ML EB），以解決圓形基片（松弛光1）和超螺旋DNA產(chǎn)物的缺口和線狀DNA。如果您不確定要運(yùn)行哪個(gè)，我們建議您嘗試運(yùn)行兩個(gè)凝膠系統(tǒng)，并將您的樣品分為兩個(gè)部分。通常在反應(yīng)中有足夠的DNA來運(yùn)行兩種凝膠體系。

i.樣品反應(yīng)（20 ul，顯示添加順序）：

?無菌蒸餾H20：根據(jù)需要變化，使體積達(dá)到20 ul?5x分析緩沖液：4 u?phot1松弛DNA：1 ul（根據(jù)需要變化）**松弛DNA的數(shù)量取決于靈敏度和檢測方法。用溴化乙錠常規(guī)染色，約250納克的DNA通常是足夠的；然而，較少的可用于更敏感的染色?；匦福? ul（始終在冰上后添加酶，并將所有試管轉(zhuǎn)移到熱塊以啟動反應(yīng)序列）。

脫氧核糖核酸凝膠的非EB凝膠分析方法：
1。在37℃下孵育30-60分鐘。

2。添加1/5體積的停止緩沖液/加載染料。
三。加入蛋白酶k至50ug/ml，37℃消化10-30min（可選步驟）。

4。加入20ul氯方：異戊醇（24:1混合物），短暫旋渦，抽出藍(lán)色，水相。

5。將藍(lán)色相裝入1%瓊脂糖（50x TAE緩沖液：242 g Tris堿、57.1 ml冰醋酸、100 ml 0.5m EDTA）。

6。電泳直到染料從凝膠中傳播60-75%。

7。用0.5 ug/ml溴化乙錠染色30分鐘（注意，EB是誘變劑，戴手套）。

8。去污（蒸餾水）室溫10-30分鐘（用手套處理凝膠）。

9。用紫外線透照儀拍攝。

電泳分析反應(yīng)產(chǎn)物：對于每一種凝膠，進(jìn)行陰性對照（松弛DNA缺乏促旋酶）。陰性對照組看起來與回旋酶反應(yīng)產(chǎn)物非常不同（回旋酶反應(yīng)產(chǎn)物遷移速度更快，形成超螺旋DNA；見圖2）。

常見問題。

什么是關(guān)鍵的控制，使我可以清楚地識別藥物，是影響DNA回旋酶使用這種分析？-標(biāo)記dna（超螺旋、線性dna）是非常重要的。-一定要進(jìn)行陽性藥物控制（如氟喹諾酮類藥物），以顯示良好的切割活性。你應(yīng)該看到線性DNA的增加。-包括一個(gè)陰性對照（要么沒有藥物，要么是topo ii藥物，如依托泊苷）。未提供vp16或etoposide，但我們已提供。-一定要檢查溶劑效應(yīng)。二甲基亞砜或甲醇等溶劑用于溶解一些試驗(yàn)藥物。用無藥物但有溶劑（如1%二甲基亞砜）的對照反應(yīng)進(jìn)行試驗(yàn)。

我應(yīng)該買哪種瓊脂糖？任何無核酸酶瓊脂糖的合理質(zhì)量，從任何來源都可以使用（西格瑪奧爾德里奇工程）。

什么是好的凝膠緩沖液使用？瓊脂糖凝膠（1%）和流動緩沖液可以是任何標(biāo)準(zhǔn)的非變性電泳緩沖液（例如，制備50X的TAE凝膠緩沖液：242克TrI堿，57.1毫升冰醋酸和100毫升0.5米EDTA）。稀釋到1X用于凝膠分離。確保凝膠也有1X的TAE緩沖液。
我應(yīng)該使用EB凝膠還是非EB凝膠？如何使用EB凝膠？-通常，在不存在溴化乙錠（EB）的情況下，可以使用1%種凝膠（這些凝膠是測試酶活性的理想材料）；然而，在該凝膠體系中，不能清楚地識別切口圓形的DNA產(chǎn)物。如上所述，含有EB的凝膠（0.5微克/毫升，EB在凝膠和緩沖液中）將提高裂解產(chǎn)物的分辨率（切口開環(huán)和線性DNA）。在對數(shù)據(jù)進(jìn)行光聚焦之前，請務(wù)*水沖洗15分鐘。-在某些情況下，取決于凝膠是如何運(yùn)行的，拓?fù)洚悩?gòu)體分布會干擾您看到卵裂產(chǎn)物的能力；然而，EB凝膠去除了這種并發(fā)癥。-重要的是：如果不確定是否運(yùn)行EB或非EB凝膠，我們建議您同時(shí)運(yùn)行。簡單地把你的反應(yīng)分成相等的部分，同時(shí)運(yùn)行兩個(gè)凝膠。這樣，你一定會看到所有的反應(yīng)產(chǎn)物，并加強(qiáng)你對實(shí)驗(yàn)的解釋。凝膠體系中的所有標(biāo)記（例如，超螺旋、松弛、線性），將獲得非常清楚和明確的結(jié)果。

時(shí)間和電壓方面的運(yùn)行條件是什么？-以1.5-2 V/cm（在電極之間測量）的速度運(yùn)行凝膠，直到染料前沿移動約80%——運(yùn)行后，非EB凝膠應(yīng)在光照前用EB（0.5 ug/ml）染色15-30分鐘，然后在水中或緩沖液中降解15分鐘。EB凝膠在0.5μg/ml（凝膠和流動緩沖液）的存在下運(yùn)行，然后在光記錄之前用水染色15分鐘。-重要提示：盡量不要讓凝膠在一夜之間運(yùn)行，但保持電泳時(shí)間少于1-2小時(shí)。長時(shí)間導(dǎo)致帶擴(kuò)散，降低凝膠效果的質(zhì)量。

你建議這些分析的反應(yīng)量是多少？-反應(yīng)體積應(yīng)為20-30UL終體積（受可加載到瓊脂糖凝膠的威爾斯的體積的限制）。-這些反應(yīng)應(yīng)該在冰上的微乳管中進(jìn)行（水、緩沖液、DNA、測試化合物和酶，應(yīng)后添加）。-加入酶后，應(yīng)將試管轉(zhuǎn)移到加熱塊以啟動反應(yīng)。

不管我是用大規(guī)格的凝膠還是迷你凝膠都有關(guān)系嗎？-兩種都可以。微凝膠非常方便，運(yùn)行時(shí)間也相當(dāng)快。-井槽的實(shí)際形狀和大小是影響波段分辨率的一個(gè)因素。好用一把長而薄的長方形梳子

終止條件對檢測解理是否至關(guān)重要？-是的。反應(yīng)應(yīng)孵育30分鐘（37°C），終止于快速加入1/10體積的10% SDS，然后在加載凝膠之前用50μg/ml蛋白酶K消化。將sds添加到37°的反應(yīng)中，以便于將酶捕獲在裂解復(fù)合物中。-此外，如果在加入sds之前加熱、冷卻或用高鹽處理反應(yīng)，topo斷裂和再密封平衡可能會改變，斷裂可以再密封。

為什么需要蛋白酶k？-捕獲topo/dna復(fù)合物的藥物會在dna和蛋白質(zhì)（topo）之間誘導(dǎo)共價(jià)復(fù)合物，這種蛋白質(zhì)必須被去除（降解）。不這樣做將阻止解理產(chǎn)物的檢測。-如果在sds之前對反應(yīng)進(jìn)行加熱、冷卻或高鹽處理，topo-dna斷裂和再密封平衡可能會改變，斷裂可以再密封。

你能幫我們解釋一下數(shù)據(jù)嗎？-是的，我們一定能幫上忙！好的方法是將您的數(shù)據(jù)（support@topogen.com）和實(shí)驗(yàn)的完整描述發(fā)送給我們。我們會很快給你反饋。
你能給我們看一些真實(shí)的凝膠數(shù)據(jù)并討論結(jié)果嗎？-是的，我們可以。結(jié)果和有益的討論如圖2所示（見圖例）。

圖2.在非EB凝膠體系上分解反應(yīng)產(chǎn)物

回旋酶反應(yīng)在20ul的終體積中進(jìn)行（見上述方案）。用1%sds終止反應(yīng)，蛋白酶k消化，cia萃取。凝膠在50V下運(yùn)行45-50分鐘，并用EB（非EB凝膠）按上述方案染色。數(shù)據(jù)顯示了松弛DNA的位置以及回旋反應(yīng)產(chǎn)物（超螺旋DNA）。與氟喹諾酮（環(huán)丙沙星）的反應(yīng)在右邊后一條車道上產(chǎn)生一個(gè)線性的DNA切割產(chǎn)物（用一個(gè)小三角形標(biāo)記）。對于凝膠數(shù)據(jù)的完整解釋，重要的是包括放松的DNA、線性DNA標(biāo)記以及控制旋回酶和回轉(zhuǎn)酶+藥物，如這里所示。